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本试剂盒可以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失或插入。基因定点突变常用于研究基因的转录调控、RNA或蛋白质的结构和功能，以及用于质粒中部分序列的微调等。本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。

本试剂盒使用了最新的保真性更强，灵敏度更高，扩增速度可达2kb/min，扩增长度可达12kb的BalbFusion DNA Polymerase，从而大大缩短了突变反应所需的时间，进一步提高了基因定点突变的成功率。同时进一步严格验证了试剂盒中的DpnI，确保能在5分钟内充分消化掉甲基化的模板质粒，同时不会消化未甲基化的PCR产物。

本试剂盒利用了目前最常用的基因点突变技术，只需通过基于PCR的突变质粒的生成，和基于DpnI的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图1)。DpnI消化仅需5分钟，累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。

图1.基因定点突变试剂盒原理图。使用本试剂盒时需要先设计长度通常为25～45个碱基互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于DH5α等dam⁺大肠杆菌，在这些dam⁺细菌中质粒会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后，突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。


本试剂盒分别使用6kb和12kb的质粒进行了点突变测试，实测突变率接近100%(参考图2)。实际进行点突变时，可能会因为突变引物的设计、模板使用量、感受态效率等因素出现不同的突变率。

图2.本试剂盒实际使用效果图。

• 使用本试剂盒进行点突变获得的LB平板照片。以一个6kb质粒为模板，使用本试剂盒进行PCR扩增以实现点突变，DpnI 37℃消化5min，取10μL产物转化100μL DH5α感受态，涂板后37℃培养过夜所获得的LB平板照片。
  
• 阴性对照LB平板照片。与A相比没有添加BalbFusion DNA Polymerase，这样模板质粒完全被DpnI酶所消化，没有任何的假阳性克隆产生。
  
• 突变前后的测序图。突变前的测序结果(WT,wild type)和从图A中挑取9个克隆的测序结果(Mu,mutant)。箭头所示为拟突变的位点，红色下划线的为突变前和突变后的碱基。本次实验的突变率达到了100%。

组分	10T	50T
BalbFusion DNA Polymerase	10μL	50μL
10×BalbFusion Buffer (with Mg2+)	100μL	500μL
dNTP Mix (2.5mM each)	100μL	500μL
DpnI	10μL	50μL
DH5α甘油菌	200μL	1mL
Nuclease-Free Water	1mL	5mL

保存：-20℃，有效期一年。

• 需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。
  
• 需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。
  
• 使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 引物设计：
  用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：
  
  • 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
    
  • 引物的长度通常为25～45个碱基。
    
  • 利用如下公式进行引物Tm值的估算，通常Tm值应该不低于78℃。
    Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - (675/N) -%mismatch
    N表示引物所含碱基总数
    %GC表示引物中GC碱基数占引物总碱基数的百分值，例如GC含量为50%，那么%GC就是50。
    %mismatch表示引物中突变碱基数占引物总碱基数的百分值，例如错配率是2.5%，那么%mismatch就是2.5。
    例一：对于模板序列5'-CCAATTTCGAGGAATTAGAACCTTATTTTGAACTTACTGAAGG-3'，其中带有灰色阴影的A为待突变位点，需要突变为C，设计正向突变引物如下:
    5'-CCAATTTCGAGGAATTAGCACCTTATTTTGAACTTACTGAAGG-3'
    Tm = 81.5 + 0.41*(15/43)*100 - (675/43) - (1/43)*100 = 77.8
    例二：对于模板序列5'-GGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGA-3'，其中两个有灰色阴影的A为待突变位点，均需要突变为G，设计正向突变引物如下：
    5'-GGGAGCTCACCAGGCTGAGGAGCACCTACATTGA-3'
    Tm = 81.5 + 0.41*(20/34)*100 - (675/34) - (2/34)*100 = 79.9
    对于插入、缺失型的突变引物，推荐利用如下公式进行引物Tm值的估算：
    Tm=81.5 + 0.41(％GC)?(675/N)
    此公式中，N不包含插入或缺失的碱基。因为如果N包含插入或缺失的碱基，数字可能会比较大，从而影响计算结果。
    
  • 也可以利用如下公式进行引物设计。
    引物中突变位点任何一侧都必需满足4*(GC碱基数) + 2*(AT碱基数) ≥ 45。但引物也不宜过长，否则通常会形成非常稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。
    例如引物为AGTCAGGCCAATTCGAAGCAGTCGAATTGCCAAG，其中有灰色阴影的AAG为突变位点，则
    左侧：4*(GC碱基数) + 2*(AT碱基数) ＝ 4*8 + 2*7 ＝ 46 ≥ 45
    右侧：4*(GC碱基数) + 2*(AT碱基数) ＝ 4*8 + 2*8 ＝ 48 ≥ 45
    
  • 上述c和d这两种方法的计算标准有较明显的差异，但经过多次测试，两种方法都可以顺利获得预期的突变。
    
  • 在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40～60%。
    
  • 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可通过一些软件进行分析。
    
  • 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。
• 引物的配制：
  如果合成得到的一个引物A的量是20nmol，另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200μL水，配制成浓度为100μM，在引物B中加入190μL水也配制成浓度为100μM。吸取20μL 100μM引物A和20μL 100μM引物B到一新的离心管中，再加入160μL水，混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10μM each)。
  
• 待突变模板质粒的选择：
  选择GC含量在40～55%的待突变模板质粒，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量最好也在40～55%的范围，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板，或者有局部高GC含量的质粒模板，请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。
  必须使用从dam⁺的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常用的大部分大肠杆菌都是dam⁺的，包括DH5α、JM109等。
  
• 基因定点突变反应：
  
  • 如下设置基因定点突变反应体系：
    

    成分	扩增片段小于6kb		扩增片段大于6kb
    	最终浓度	体积	最终浓度	体积
    Nuclease-Free Water	-	?μL	-	?μL
    10×BalbFusion Buffer (with Mg2+)	1X	5μL	1X	5μL
    引物混合物(10μM each)	0.4μM each	2μL	0.8μM each	4μL
    dNTP mix (2.5mM each)	0.25mM each	5μL	0.5mM each	10μL
    待突变模板质粒	200ng	?μL	200ng	?μL
    BalbFusion DNA Polymerase	1/50	1μL	1/50	?1μL
    总体积	-	50μL	-	50μL

    
    按照上面的顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中，根据待突变模板质粒的量，计算出需加入的Nuclease-Free Water的量，使总体积为49μL。适当混匀后，加入1μlBalbFusion DNA Polymerase，混匀。如果用的PCR仪没有热盖，在反应体系上加入一滴矿物油(mineral oil)以防止蒸发。
    
  • 按照如下参数设置PCR仪：
    

    步骤	循环数	温度	＜6kb时的时间	＞6kb时的时间	说明
    1	1	95℃	3min	3min	最初变性
    2	20	95℃	30sec	30sec	变性
    		55℃	30sec	30sec	退火
    		68℃	30sec/kb	60sec/kb	延伸
    3	1	68℃	10min	15min	延伸、补全
    4	1	4℃	长时间保持	长时间保持	暂时存放

    
    说明：上面表格中30sec/kb表示，如果待突变的质粒为6kb，那么68℃的延伸时间为3分钟。60sec/kb的含义相同。
• DpnI消化：
  PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1μL DpnI，混匀后37℃孵育5min。37℃孵育可以在PCR仪上进行，也可以在水浴锅中进行。DpnI消化完毕后可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。
  
• 转化、挑克隆鉴定：
  感受态细菌的转化效率必需至少在107以上，否则很难得到克隆。根据所使用的感受态细菌，加入尽量多的经过DpnI消化后的突变产物用于转化。通常每100μL感受态细菌中可以加入5～10μL经过DpnI消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作，在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌，全部涂布到含有适当抗生素的平板上，培养过夜。通常会得到100个以下的克隆。如果发现有上千个克隆，那么通常是有什么地方出了问题。
  对于得到的克隆，可以挑取3～5个克隆送样测序去测序，以确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。通常大部分的是预期的突变克隆。但有时也可能会因为随机因素，会测序了3～5个克隆才得到一个预期的突变克隆。

• 转化后没有克隆或克隆数极少：
  
  • 感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在10⁷以上，当然高一些更好。
    
  • 把DpnI消化后的产物用常规的乙醇沉淀方法进行沉淀，然后溶解在较小的体积中。这样就可以把所有的产物全部用于转化。
    
  • 优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为5min，循环中95℃变性的时间延长至1min，把循环中的68℃的延伸时间改为1min/kb至2min/kb，退火可以改为60～55℃或65～55℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。
    
  • 引物设计有问题。通过突变反应中的PCR没有很好地扩增出预期的突变质粒。
    
  • 如果使用矿物油(mineral oil)，在转化时如果把矿物油带入感受态菌，会严重影响转化效率。
• 有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克隆：
  
  • DpnI消化效果不佳。一种可能是加入DpnI后，由于该酶在甘油中，会迅速下沉，如果没有混匀就会严重影响DpnI的消化作用。另一种可能是DpnI由于保存不当或保存时间过长等原因导致活性下降，这时可以适当延长消化的时间至1～2小时。
    
  • 使用的待突变的模板质粒量过多，导致DpnI消化时不完全。我们这里推荐的模板质粒用量0.5μg，已经是模板质粒用量的上限，不能再使用更多的模板质粒了。
    
  • 尽量避免多次反复冻融dNTP。可以把dNTP适当分装后再使用。
• 有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：
  
  • 引物设计不佳，并且PCR反应中退火温度过低，导致引物退火到错误的地方。
    
  • 引物质量较差，没有经过PAGE纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物，容易导致非预期的突变。

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